Determinación de Proteína en Leche - Método Walker

Es un método rápido en la determinación de proteínas en leche fresca. Al adicionar formol a la muestra en exceso (la leche ya ha sido previamente neutralizada), este reacciona con cada grupo amino de lisina y arginina (grupo metilenoimino – N=CH 2 ), dejando libre a los grupos carboxilos, por lo que habrá ganado acidez la leche, debido al exceso de formol, por lo que se neutraliza con un exceso de álcali estándar (NaOH), el cual se titula, y se relaciona con el contenido de proteína presente en la muestra . El contenido proteico se obtiene multiplicando el valor obtenido en la titulación por un factor empírico, y a su vez, para obtener el % Caseína se multiplica por su respectivo factor empírico:

Se realizó la determinación de proteínas en diferentes muestras de leche mediante el método Walker a temperatura ambiente en el Laboratorio de Biotecnología de los Productos Agroindustriales de la Universidad Nacional de TrujilloSe puede considerar que nuestra muestra base contiene tres componentes básicos: agua, grasa y sólidos no grasos (SNG). La materia orgánica de la porción no grasa consiste principalmente de las proteínas (caseina 80%, albúminas 5% y globulinas 12%), lactosa y ácidos láctico y cítrico.

Fig. 1. Muestras de Leche a analizar.

Tabla 1. Resultados Obtenidos del Análisis

Fig. 2. Gráfico comparativo del análisis de proteína.

Estableciendo comparaciones entre los valores teóricos indicados en los envases de cada muestra (Figura 1) y nuestros resultados experimentales (Cuadro 1), podemos observar que nuestro resultado para la leche fresca es muy cercano al teórico, con un error aceptable. La misma observación para el valor experimental de proteínas presentes en la leche de soya que, al igual que la muestra anterior, también se acerca al valor teórico, con un error aceptable.

Según Bejarano (2002), el valor proteico de la leche fresca es de 3.2, confirmándonos así lo mencionado en el párrafo anterior, al haber obtenido diferencias pequeñas, podemos decir que se realizó una experimentación aceptable para dicha muestra.

Lo contrario se observa para las muestras de leche evaporada, leche en polvo, y leche UHT; en las que se evidencia una considerable diferencia entre los valores experimentales reportados y los valores teóricos indicados en su envase. La diferencia más significativa la tiene el valor encontrado para la leche en polvo. Dichos errores groseros se pueden deber muchos factores. Uno de los principales es que el Metodo Walker es usado para análisis rápido en leche fresca, también podemos mencionar algunos: errores de parte del experimentador, falta de calibración de instrumentos utilizados, estado de conservación de las muestras, falta de pureza en el formaldehido utilizado y como factor más determinante, la marca de cada producto.

BIBLIOGRAFÍA

BEJARANO, I. 2002. Tabla de composición de alimentos industrializados. Centro Nacional de Alimentación y Nutrición. Perú.

FENNEMA, O. 2000. Química de los alimentos. Segunda Edicion. Editorial Acribia S.A. España.

BOLAÑOS, N. 2003. Química de Alimentos: Manual de laboratorio. Primera Edición. Editorial Rodrigo Facio. Costa Rica.

¿Como saber si el agua usada en el HPLC es ultrapura?

El HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución) es un equipo que tiene una alta sensibilidad y resolución tanto es así que los solventes usados para esta técnica son de un grado tal que no puedan ser identificados por el detector (Grado HPLC)
Antes de realizar el test de pureza de agua, los solventes deben ser filtrados (máximo 0.45 um) y sonicados (20 minutos para el agua y 10-15 min para los demás solventes)
Se sabe que los solvente grado HPLC ya vienen filtrados y desgasificados, algunos omiten este paso, pero como dicen por ahí más vale prevenir que lamentar.
Una columna C18, es excelente para realizar estos tipos de test. Seleccionamos 254 nm de longitud de onda del detector, luego lavamos la columna a un flujo de 1 ml/min  estableciendo así una linea base UV plana, luego bombear agua a flujo de 1ml/min durante 30 min. Esto permite que las impurezas no polares se acumulen en la columna. El paso final es volver a Acetonitrilo ejecutanto un gradiente hasta 100 de acetonitrilo durante 20 min. Si no aparecen picos después de 5 min en las condiciones finales, el agua es buena. El cromatograma de la Fig. 1 te da  una apariencia de la linea base esperada

Fig.1 Cromatograma para test de Agua Ultrapura. La lineas superiores al cromatograma indican el gradiente de este

Los picos que aparecen durante el primer lavado con acetonitrilo se ignoran como impurezas ya en la columna. Observe la línea de base al cambiar al agua. A 254 nm, la línea de base debe elevarse gradualmente. Si en cambio se cae, puede haber impurezas en su acetonitrilo. Si la línea de base hace cambio muy fuerte antes de nivelar, puede tener una gran cantidad de impurezas polares en el agua. Las impurezas polares probablemente no le molestarán en columnas de fase reversa, pero podrían tener algunos efectos de acumulación a largo plazo. Los picos que aparecen durante el gradiente de acetonitrilo provienen de impurezas no polares en el agua que se acumulan en la columna y están ahora eluyendo.
Si su agua pasa esta prueba a la longitud de onda que utilizará para su cromatografía, estará listo para usarla para equilibrar la columna.