Antes de realizar el test de pureza de agua, los solventes deben ser filtrados (máximo 0.45 um) y sonicados (20 minutos para el agua y 10-15 min para los demás solventes)
Se sabe que los solvente grado HPLC ya vienen filtrados y desgasificados, algunos omiten este paso, pero como dicen por ahí más vale prevenir que lamentar.
Una columna C18, es excelente para realizar estos tipos de test. Seleccionamos 254 nm de longitud de onda del detector, luego lavamos la columna a un flujo de 1 ml/min estableciendo así una linea base UV plana, luego bombear agua a flujo de 1ml/min durante 30 min. Esto permite que las impurezas no polares se acumulen en la columna. El paso final es volver a Acetonitrilo ejecutanto un gradiente hasta 100 de acetonitrilo durante 20 min. Si no aparecen picos después de 5 min en las condiciones finales, el agua es buena. El cromatograma de la Fig. 1 te da una apariencia de la linea base esperada
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| Fig.1 Cromatograma para test de Agua Ultrapura. La lineas superiores al cromatograma indican el gradiente de este |
Los picos que aparecen durante el primer lavado con acetonitrilo se ignoran como impurezas ya en la columna. Observe la línea de base al cambiar al agua. A 254 nm, la línea de base debe elevarse gradualmente. Si en cambio se cae, puede haber impurezas en su acetonitrilo. Si la línea de base hace cambio muy fuerte antes de nivelar, puede tener una gran cantidad de impurezas polares en el agua. Las impurezas polares probablemente no le molestarán en columnas de fase reversa, pero podrían tener algunos efectos de acumulación a largo plazo. Los picos que aparecen durante el gradiente de acetonitrilo provienen de impurezas no polares en el agua que se acumulan en la columna y están ahora eluyendo.
Si su agua pasa esta prueba a la longitud de onda que utilizará para su cromatografía, estará listo para usarla para equilibrar la columna.
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